Nat Chem Biol | 季泉江团队开发极小型CRISPR-Cas12f基因编辑工具
CRISPR/Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性，已经被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前广泛使用的Cas9与Cas12a核酸酶均具有较大的分子尺寸（通常大于1000个氨基酸），而广泛应用于基因治疗中的腺相关病毒（AAV）载体的承载容量却十分有限，在容纳CRISPR核酸酶与引导RNA的编码序列之余往往难以承载更多其他功能元件，这严重限制了其在基因治疗等领域的应用。因此，亟需发掘与鉴定具有更小分子尺寸的CRISPR核酸酶以解决这一技术难题。
近年来，多种具有较小分子尺寸的CRISPR核酸酶，如CasX (系统命名为Cas12e, 986个氨基酸)和CasΦ (系统命名为Cas12j，700-800个氨基酸) ，已被发现并鉴定【1,2】。而在CRISPR系统中V-F亚型的效应因子具有最小的分子尺寸，通常在400-700个氨基酸左右。在2018年，Jennifer A. Doudna团队在Science杂志发表研究论文，发现隶属于V-F型CRISPR系统的Cas14核酸酶能够不依赖PAM序列进行单链DNA的靶向切割，但该核酸酶在大肠杆菌中并不能靶向干扰质粒转化【3】。在2020年，Eugene V. Koonin团队在Nature Reviews Microbiology发表综述文章将Cas14核酸酶和其他V-F效应因子归类并系统命名为Cas12f核酸酶【4】。同年，Virginijus Siksnys团队在Nucleic Acids Research杂志发表研究论文，发现Cas12f核酸酶可以在体外实现PAM依赖性的靶向双链DNA切割【5】。然而Cas12f核酸酶是否具有作为一种新型基因编辑工具的潜力仍尚不明晰。
2021年9月2日，上海科技大学季泉江团队在Nature Chemical Biology杂志发表了题为Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease的研究论文。文章系统性表征了一种极小型CRISPR核酸酶—AsCas12f1（仅422个氨基酸）的DNA识别和切割机制，并探究了它作为一种新型基因编辑工具的可能性，成功在细菌和哺乳动物细胞中实现了高效的基因编辑。此研究又一次拓展了CRISPR核酸酶工具库，为开发微型精准基因编辑和治疗工具提供了新的思路。
研究人员首先通过高通量PAM depletion试验鉴定发现AsCas12f1核酸酶可特异性识别的最优PAM序列为5’-TTR（R代表A或G）。而当5’-TTY序列作为PAM时，其-4位的碱基类型将会影响靶向干扰质粒转化的活性。而后研究者通过Small RNA-seq揭示了AsCas12f1发挥功能所必须的RNA元件为tracrRNA和crRNA组成的二元复合体。而tracrRNA和crRNA可进一步融合为单一的sgRNA，同时能显著提升双链DNA切割活性。AsCas12f1能在靶向链的spacer序列下游3 bp处引入一个切口，同时还能在非靶向链上PAM序列下游12 bp处和spacer下游约5 bp处分别引入两个切口，最终产生带有不对称粘性末端的双链DNA断裂。同时，AsCas12f1还能不依赖PAM序列靶向切割单链DNA。并且靶向切割能激活其附加切割活性，非特异性降解其他单链DNA。
为探究AsCas12f1在基因编辑中的应用潜能，研究人员首先分别向大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中引入AsCas12f1，以及用于增强细菌内同源重组活性的Lambda Red重组酶系统和单链DNA修复模板。这一方法实现了在这两种细菌中的高效精确基因删除和点突变。而后研究人员又将AsCas12f1分别通过质粒、核糖核蛋白复合体（RNP）以及腺相关病毒（AAV）等方式导入哺乳动物细胞中，并成功在靶位点引入了缺失或插入突变（Indel）。
AsCas12f1是目前已知分子尺寸最小（仅422个氨基酸）的且在哺乳动物细胞中具有基因编辑能力的CRISPR核酸酶。它的发现与鉴定为分子生物学、生物医学研究和临床治疗提供了新的工具。而基于AsCas12f1或同家族的其他极小型CRISPR核酸酶或能开发出更多可实现单AAV包装的复合型CRISPR基因操作工具。
季泉江课题组助理研究员吴兆韡为第一作者，季泉江教授为通讯作者。芝加哥大学何川教授为该研究提供了宝贵意见。上海科技大学生命学院黄行许教授、刘如娟教授、李静博士、中山大学骆观正教授为该研究提供了帮助。
值得一提的是，在同一天Nature Biotechnology杂志上同时在线了韩国生命工学研究院的Yong-Sam Kim实验室发表题为Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus的论文（详见BioArt今天另一条报道）。文章通过gRNA的系统改造，成功开发出迷你版CRISPR系统Cas12f1。该系统在哺乳动物细胞中的基因编辑活性可媲美传统的SpCas9，而体积仅529氨基酸，可满足AAV病毒递送系统对体积的严苛要求。这一研究让CRISPR为基础的基因编辑工具成功摆脱了“体型”困扰，为基因治疗的临床应用提供了新利器。
参考文献
1. Liu, J.J. et al. CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature 566, 218-223 (2019).
2. Pausch, P. et al. CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369, 333-337 (2020).
3. Harrington, L.B. et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science 362, 839-842 (2018).
4. Makarova, K.S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat. Rev. Microbiol. 18, 67-83 (2020).
5. Karvelis, T. et al. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic Acids Res. 48, 5016-5023 (2020).
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